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乙肝病毒核心区基因变异与细胞免疫

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日期:2006-12-12 来源:景天阁·健康资讯
内容提示:李嘉朱理珉梁树人李顺天徐健【摘要】目的探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)核心区Leu60Val变异与机体细胞免疫水平的关系。方法通过流式细胞分析技术(FCM)检测外周血T淋巴细胞亚群,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子[干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)...

李嘉朱理珉梁树人李顺天徐健

【摘要】目的探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)核心区Leu60Val变异与机体细胞免疫水平的关系。方法通过流式细胞分析技术(FCM)检测外周血T淋巴细胞亚群,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子[干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)]水平,采用聚合酶链反应(pCR)扩增HBVDNAC基因区片段,并对pCR产物直接测序。结果91例慢性乙型肝炎患者发生Leu60Val变异者19例,变异率为20.9%,随病情加重变异率逐渐增加,以重型肝炎组最高;Val60变异株组IFN-γ、TNF-α水平明显增高(t值分别为2.584、4.766,p<0.01),CD4+/CD8+比值逐渐升高(t=2.275,p<0.05)。结论Val60变异株可能通过增加与Ⅰ类人白细胞抗原(HLA-I)的亲和力,或上调HLA-I类分子的表达,从而激活大量的细胞毒性T淋巴细胞释放细胞因子,并同时在肝脏局部发挥免疫效应,提高对宿主的杀伤力。

【关键词】肝炎病毒,乙型;变异;细胞因子;T淋巴细胞亚群;序列

RelationshipbetweentheHBVcoregenemutationandthecellularimmunityinhostLIJia,ZHULi-min,LIANGShu-ren,LIShun-tian,XUJian.TianjinInfectiousDiseasesHospital,Tianjin300192,China

【Abstract】ObjectiveTostudytherelationshipbetweenthemutationofLeu60ValinHBVcoreregionandthecellularimmunityinpatientswithchronichepatitisB(CHB).MethodsHBVDNACgenemutationwasconfirmedbypolymerasechainreaction(pCR)andsequencingtheproductsdirectly.Thecytokines(IFN-γ,TNF-αandIL-2)levelsinserumweremeasuredbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).ThedistributionofT-lymphocytesubpopulationsinperipheralbloodwasdetectedbyflowcytometry(FCM).ResultsThemutationofLeu60Valwasfoundin19outofthe91CHBpatients.WiththeCHBseverity,themutationratewasgettinghigher,especiallyintheseverehepatitisgroup.TheIFN-γandTNF-αlevelsweremuchhigherinmutantstraingroupthanthoseinwildstraingroup(t=2.584,4.766,p<0.01),sowastheratioofCD4+/CD8+(t=2.275,p<0.05).ConclusionThemutantstrainof60ValmayincreaseaffinitytoHLA-Imolecule,orup-regulatetheexpressionofHLA-Imolecule,resultingintheactivationofCTLtoreleasethecytokinesandcauseimmuneresponseinliver.

【Keywords】HepatitisBvirus;Mutation;Cytokines;T-lymphocytesubpopulations;Sequence

慢性乙型肝炎患者的肝细胞损伤主要是由于机体针对乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)发生的免疫反应所引起,其中作为效应细胞的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)是肝细胞发生病理损害的主要介导者,而针对HBV核心抗原(hepatitisBcoreantigen,HBcAg)的CTL应答是决定病毒是否被清除的关键。当HBV基因发生变异,可以改变氨基酸分子的表达,尤其当CTL识别的重要表位发生变异会改变机体针对病毒的免疫反应。本实验通过对HBVDNAC基因区进行核苷酸序列分析,并同时检测患者外周血T细胞亚群(CD4+、CD8+)及血清细胞因子水平[γ干扰素(interferonγ,INF-γ)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)及白细胞介素2(interleukin2,IL-2)],从而了解HBV核心区第60位亮氨酸变异为缬氨酸(Leu60Val)的情况及机体的免疫状况,探讨在慢性乙型肝炎中,HBV核心区Val60变异株与机体细胞免疫水平的关系。

资料与方法

1.病例选择:病例为天津传染病医院1999年10月~2001年10月收治的91例慢性乙型肝炎患者,其中轻度21例,年龄(34.95±11.38)岁;中度24例,(36.05±13.45)岁;重度23例,(35.45±10.47)岁;重型肝炎23例,(39.71±12.20)岁。血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒血清学标志检测均阴性。诊断符合符合2000年西安修订的病毒性肝炎诊断标准。

2.HBVDNAC基因区扩增及序列分析:根据GeneBank公布的31条HBV全基因序列,选取C基因区两端保守区域,设计合成2条特异性引物(C1和C2)进行pCR扩增,并经pcrdesn软件进行检验,测序引物为C3。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物C15′-TGGAGACCACCGTGAACGCC-3′(nt1609~1628),C25′-AAAGACAGGTACAGTAGAAG-3′(nt2516~2497),C35′-GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG-3′(nt2364~2388)。dNTp为美国Gibco公司产品,TaqDNA聚合酶、Tris饱和酚购于北京鼎国生物技术发展中心,DNA测序试剂盒为加拿大VisibleGenetic公司的末端标记试剂盒及OpenGene自动DNA测序仪和Version3.0进行DNA测序电泳及序列分析。提取血清DNA,采用pCR扩增HBVDNAC区基因,电泳后在紫外光下检测pCR产物,采用琼脂糖凝胶电泳回收法回收产物,并进行产物的纯化,采用双脱氧链末端终止法进行测序反应,对测序产物纯化后进行测序电泳。

3.血清细胞因子检测:IFN-γ、TNF-α和IL-2试剂盒购自美国Gibco公司。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测,一抗为生物化学抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的streptavidin,用标准品绘制曲线并计算429nm吸光度时标本浓度。

4.外周血T细胞亚群的检测:采用流式细胞术,选用三色荧光标记的免洗试剂(TriTESTTMCD4FITC+CD8pE+CD3perCp)直接荧光染色。荧光标记试剂、红细胞裂解液及同型对照均为美国BD公司的产品。取抗凝血1ml,先将白细胞数调至(4.0~10)×109/L,在管底部加入CD3/CD4/CD8三色直标荧光抗体20μl和混匀的肝素抗凝血100μl,彻底混匀后室温避光30min。加1×红细胞裂解液1ml于试管内充分混匀,室温避光保存15min,上机检测。

5.统计学处理:各组间率的比较用χ2检验,各组间均数比较用t检验,方差分析用F检验。

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