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拉咪呋定治疗前后乙型肝炎病毒YMDD变异株的演变

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日期:2006-12-12 来源:景天阁·健康资讯
内容提示:拉咪呋定是有效的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物,已在临床广泛应用,但可因YMDD变异而耐药。对拉咪呋定的耐药机制,国外学者从不同的角度进行了研究:有些学者认为拉咪呋定治疗过程中出现YMDD变异后HBVDNA多聚酶的结构发生改变,与拉咪呋定的结合能力下降而致它的耐药。而且在未进行拉咪呋定治疗的患者的血清中检测出YMDD变异...

拉咪呋定是有效的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物,已在临床广泛应用,但可因YMDD变异而耐药。对拉咪呋定的耐药机制,国外学者从不同的角度进行了研究:有些学者认为拉咪呋定治疗过程中出现YMDD变异后HBVDNA多聚酶的结构发生改变,与拉咪呋定的结合能力下降而致它的耐药;而且在未进行拉咪呋定治疗的患者的血清中检测出YMDD变异株,但未见拉咪呋定治疗患者的病毒株组成分析的报导。本文克隆分析了拉咪呋定治疗前和治疗48W时病毒株的变化与临床之间的关系,进一步探讨拉咪呋定的耐药机制。

材料与方法

1.患者与血清标本:根据2000年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案,5例上海地区慢性HBV感染者(表面抗原阳性,DNA斑点法阳性,病程6个月以上)用拉咪呋定100mz/日口服治疗,治疗48W时HBVDNApCR仍阳性,选择治疗前与治疗48周的血清标本进行分析。

2.方法

2.1HBV血清标志及核酸检测:血清中乙型肝炎病毒表面抗原/抗体(HBsAg/HBsAb)及乙型肝炎病毒e抗原/抗体(HBeAg/HBeAb)用微粒酶免疫方法检测(Axsym,Abbett,USA),HBVDNA用斑点杂交法(治疗前)和bDNA信号扩增法(治疗过程中)检测。

2.2血清HBVDNA的抽提与扩增:蛋白酶K裂解,酚、氯仿抽提,酒精沉淀。扩增包括YMDD区域在内的片段长度为500bp,引物为S2(5’—TATGTTGCCCGTTTGTCCTC—3’,nt462-481),AIT(5-CCTATTCATTGGAAAGTATGTCA3’nt972-994);扩增条件为:94C5mins变性后循环温度分别为94~C30s,58~C30s、72~C1min,30个循环后,72~Cmins延伸,pCR产物进行测序及克隆。

2.3DNA序列分析:由上海生工生物技术公司测序,方法为双脱氧末端终止法,测序引物为S2。

2.4重组质粒的构建:使用Qiagene公司的pCR纯化试剂盒回收pCR产物,详细操作按说明书进行,取纯化好的pCR产物与pGEM—T载体连接,用T:DNA连接酶于15cC反应过夜。转化大肠杆菌DH5a感受菌。每份血清标本各挑20—24个单个白色菌斑。

2.5重级质粒pCR鉴定;取上述制备的重组质粒DNA1:200稀释物lp.1为模板,加人反应体系中,反应条件同上。取pCR产物10t.ti进行2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,在紫外灯下观察结果。

2.6YMDD病毒株的检测:采用实时荧光pCR方法对克隆株进行YMDD及其变异株检测(已另文发表)

结果

1.阳性克隆的鉴定:重组质粒pGEM—p经特异性引物pCR扩增,电泳观察结果,可见阳性条带,片段长为532bp。证实目的基因(HBVnt462—994)已成功克隆至载体pGEM—T中。

2.YMDD变异检测结果·

2.1克隆株:通过实时荧光pCR方法分析5例患者治疗前后IO份标本的克隆(共205株),YMDD变异株所占比例治疗前分别为10.5%、13.64%、8.7%、0.15%,治疗48W时演变为100%、100%、65%、100%、0,比较治疗前后的结果发现:YMDD变异株在部分患者中治疗前已存在,但为弱势株,随着治疗时间的延长,弱势株演变为优势株;由表1所见例1M552工、M552V所占的比率由治疗前5.25%、5.25%变为

4.2%、95.8%,例2由13.64%、0变为5.3%、94.7%,这可能因M552V变异株较M552工变异株复制力更

高,易演变为优势株;第5例患者治疗前检测出M552V,治疗48W时YMDD为优势株。2.2pCR产物直接测序:分别对5例患者治疗前与治疗48W的标本进行pCR产物直接测序,治疗前的标本均未发现YMDD变异;治疗48W时4例患者出现YMDD变异,其中2例M552V(例1、4)、2例M5521变异(例2、3),例5无YMDD变异(测序结果见图1略)。

3.YMDD及其变异株动态变化与HBVDNA,ALT之间的关系:在5例患者中HBVDNA(bDNA信号扩增法)、ALT突发2例(例2、3),HBVDNA、ALT无突发2例(例1、4),例5HBVDNA突发、ALT正常,前4例患者治疗48W均出现YMDD变异,后1例治疗48W未发现有YMDD变异。

讨论

拉咪呋定治疗慢性乙型肝炎能使HBVDNA显著下降、ALT正常、肝脏组织学改善。但是,随着治疗时间的延长,部分患者出现YMDD变异,多中心研究显示:1年时16%—32%的患者发生耐药变异,2年时达到47%-56%,3年时69%—75%,YMDD变异有M552V、M5521两种。体外实验证明这种变异病毒的复制水平显低于野毒株,但变异病毒对拉咪呋定的敏感性也明显下降。体外实验证明上述变异同拉咪呋定耐药有关。ThiBauh等认为耐药变异的出现是由于HBV多聚酶在药物的作用下不断选择性调整,使病毒具有较高复制水平。

Kobayashi等研究了未经过拉咪呋定治疗的ALT正常的HBV无症状携带者的YMDD基序的变异情况,对18例患者的血清检测YMDD及其变异株,其中5例患者检测出YMDD变异病毒。本文比较拉咪呋定治疗前后克隆株发现:YMDD变异株在治疗前的血清中已存在,随着治疗时间的延长,YMDD变异株演变为优势株,这是药物筛选,使野毒株减少,变异株获得了优势增长;我们对YMDD变异株成为优势株的演变过程与临床的相关性作了初步探讨:出现YMDD变异的患者并不一定立即有HBVDNA突发或ALT突发,HBVDNA或ALT突发不一定是YMDD变异的结果,第5例患者虽HBVDNA突发,但无YMDD变异,可能还有其它影响因素如其它部位的变异等。

同一患者治疗前血清标本通过pCR产物直接测序只能检测出一种病毒株,而它的克隆株通过实时荧光pCR检测则检测出多种病毒株并存,这是因为前者的结果代表优势株,而后者则可同时反映体内野毒株与变异株。Boucher等在研究拉咪呋定治疗艾滋病target=_blank>艾滋病过程中。出现YMDD变异时,发现M5521变异是M552V变异的中间产物。Niesters等报道了在拉咪呋定治疗慢性乙型肝炎时也可能有这种情况。在本实验中也有类似的结果:有2例患者治疗前病毒株组成均含有M5521,但治疗后M552V均变成优势株,出现这种现象的原因可能是由于M522V变异病毒的复制能力比M5521变异病毒强,而且M552V变异病毒的结构可能更稳定。

总之,在拉咪呋定治疗前患者体内野毒株为优势株,但已存在少量YMDD变异株,拉咪呋定选择性抑制了野毒林,使YMDD变异株变成优势株,因此,YMDD变异是药物筛选的结果,其中部分患者可导致拉咪呋定临床耐药;M5521可能是M552V变异的中间产物。

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