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大肠癌p53基因突变检测的临床意义

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日期:2006-11-22 来源:景天阁·健康资讯
内容提示:大肠癌为我国常见恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势。随着分子生物学理论和技术的发展,对大肠癌基因突变和表达的研究也日益广泛和深入。p53基因突变被认为是腺瘤-腺癌序列演变中的一个重要因素,并具有预后意义。本文通过对大肠癌标本的检测结合病理和临床资料探讨大肠癌p53基因突变的临床意义及其对预后的价值。

大肠癌为我国常见恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势。但其总的治疗效果仍不理想,复发和死亡屡有所见。因此如何提高治疗效果乃当务之急。随着分子生物学理论和技术的发展,对大肠癌基因突变和表达的研究也日益广泛和深入。p53基因突变被认为是腺瘤-腺癌序列演变中的一个重要因素,并具有预后意义。本文通过对大肠癌标本的检测结合病理和临床资料探讨大肠癌p53基因突变的临床意义及其对预后的价值。

材料与方法

自1996年3月~1997年3月,作者随机对手术切除的大肠癌69例标本,取癌灶组织和肿瘤远切端正常大肠粘膜组织,置-80℃中保存,用pCR-SSCp法检测p53基因第5~8外显子的突变情况。病变属Dukes′A期2例,B期35例,C期18例和D期14例。大肠癌细胞分化中,BroderⅠ级4例,Ⅱ级60例,Ⅲ级2例,Ⅳ级3例;肿瘤大体类型:增生型21例,溃疡型32例,浸润型16例。每例均取直径1cm大小的癌组织一块,制备匀浆,另取正常人外周血白细胞及正常肠粘膜组织按常规法提取DNA并配制成终末浓度为0.1μg/μl的应用液-20℃保存。

pCR-SSCp检测p53基因第5~8外显子突变情况。pCR扩增:pCR反应体系为50μl,其余各组分参照文献,p53基因点突变主要发生在外显子5、6、7、8中,四对引物设计参见文献[1~3],引物序列及反应条件如表1所示。SSCp分析:取10μlpCR反应产物,加入等体积95%甲酰胺染料(20mmol/LEDTA,0.1%溴酚兰),95℃保温7min后立即置于冰浴中7min。用8%聚丙烯酰胺凝胶(acrylamide∶bisacrylamide=49∶1),4℃条件下电泳3h(缓冲液:0.5×TBE,pH8.0),直至溴酚兰接近凝胶底部为止。凝胶用硝酸银染色;在甲醇∶水∶冰乙酸(5∶1∶4)混合液中固定0.5h,3.4mmol/L重铬酸钾、3.2mmol/L硝酸混合液中氧化10min×2次,蒸馏水中漂洗2min×4次,12mmol/L硝酸银中染色30min,蒸馏水漂洗5min,在0.28mol/L碳酸钾,0.03%甲醛中显色至条带清晰,10%乙醇-5%醋酸中定色5~10min;结果判断:通过与对照样品的条带比较,判断待析样品是否有突变存在,与对照条带有不同者存在突变,完全相同者则无突变(见表1)。

表1 用于p53基因突变检测的PCR引物及扩增条件

扩增的外显子 扩增片段长度(bp) 引物序列(5′~3′) 扩 增 条 件
5 183 TACTCCCCTGCCCCTCAACAAG 热变性 35×
  ATCGCTATCTGAGCAGCGCTC 94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min
6 114 GGTCTGGCCCCTCCTCAGCAT 热变性 35×
  CTCAGGCGGCTCATAGGGCAC 94℃ 1 min,63℃ 1 min,72℃ 1 min
7 111 GTTGGCTCTGACTGTACCACC 热变性 35×
  CCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT 94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min
8 135 TGGTAATCTACTGGGACGGAA 热变性 35×
  TCGCTTAGTGCTCCCTGGGGG 94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min
统计学处理表2中关于p53基因突变与Dukes′分期关系的统计方法,选用t检验进行统计处理。对于Dukes′D期突变组与未突变组生存期的统计,选用Kaplan-Meier生存分析法进行统计。

表2 病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期的关系

  A B C1 C2 D 合计
Ca(+)N(+) 0  8  2 1  2 13
Ca(+)N(-) 1  9  6 0  7 23
Ca(-)N(-) 1 18  9 0  5 33
总计 2 35 17 1 14 69
注:Ca为病灶组织N为正常组织(+)为p53基因突变(-)为p53基因未突变(p>0.05)

结果

69例大肠癌标本中,36例p53基因突变,突变率为52.17%,其中第5外显子突变32例,占88.89%,第5、6外显子双突变1例,第6外显子突变1例,第7和8外显子各突变1例。附图显示部分标本p53基因第5外显子扩增产物SSCp分析结果。36例p53基因突变阳性的病例中,癌组织和远切端正常粘膜均示突变阳性者13例,占36.11%(13/36)。病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期关系见表2,经统计学分析,p53基因突变与Dukes′分期无明显相关性(p>0.05)。由于随访时间较短,本文仅对Dukes′D期的14例患者进行了2~12月的随访,结果发现p53基因未突变的5例中2例死亡,死亡率40%,2例死亡患者生存期均小于5个月,5例患者平均生存期为7.2月。而p53突变的9例中7例死亡(其中2例癌灶组织、正常组织突变者均已死亡,7例癌灶组织突变、正常组织未突变的患者中,5例死亡),死亡率77.8%,7例死亡患者生存期均小于4个月,9例患者平均生存期为4.8月,Dukes′D期突变组与未突变组,经统计学处理后,生存期有显著差异(p=0.041)。

附图部分标本p53基因外显子5pCR-SSCp分析结果

 

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