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多基因单链构象多态性技术在大肠癌多基因突变联合测定中的应用

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日期:2006-11-22 来源:景天阁·健康资讯
内容提示:多基因单链构象多态性(MSSCP)是一种与多基因聚合酶链反应(PCR)联合应用,一次性快速测定多基因突变的方法。本研究建立了测定APC基因突变聚集区域(MCR)和K-ras第12/13密码子突变的MSSCP技术。样本收集:收集34例确诊的散发性大肠癌组织和21例正常人组织,同时收集30例确定有APC(MCR)或K-ras(第12/13密码子)基因突变和27例..

多基因单链构象多态性(MSSCp)是一种与多基因聚合酶链反应(pCR)联合应用,一次性快速测定多基因突变的方法。本研究建立了测定ApC基因突变聚集区域(MCR)和K-ras第12/13密码子突变的MSSCp技术。

一、材料与方法

1.样本收集:收集34例确诊的散发性大肠癌组织和21例正常人组织,同时收集30例确定有ApC(MCR)或K-ras(第12/13密码子)基因突变和27例无突变散发性大肠癌组织。

2.多基因SSCp分析:(1)引物设计与合成:按多基因pCR引物设计原则,在ApC基因MCR区域设计3对引物,在K-ras基因第12/13密码子两侧设计1对引物。(2)多基因pCR扩增。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳:5μl多基因pCR产物,加3倍体积上样缓冲液,煮沸10分钟,猝冷2~3分钟,8%聚丙烯酰胺凝胶(29∶1)电泳4~5小时。银染、干燥保存和分析异常泳带。

3.真实性评价方法。

二、结果

1.多基因pCR及MSSCp方法的建立:将4对引物混合,进行pCR扩增。空白对照未见产物,组织标本可见4条清晰条带。MSSCp结果经银染,由单基因SSCp单链定位,在相应区域可见单链条带正常或异常泳动。

2.真实性评价:MSSCp灵敏度、特异度分别为96.7%(29/30)和88.9%(24/27);各单基因SSCp特异度分别为100%(27/27)和96.3%(26/27),而灵敏度分别仅为40%(12/30)和70%(21/30),并联分析后的灵敏度为100%,特异度为96.3%(26/27)。

3.散发性大肠癌34例临床标本MSSCp测定:K-ras(12/13)阳性8例(23.5%);ApC(MCR)阳性5例(14.7%);K-ras+ApC阳性8例(23.5%)。共计阳性21例(61.8%),ApC(MCR)突变总检出率为38.2%,K-ras第12/13密码子突变总检出率为47.1%。21例正常组织未见突变。

三、讨论

检测肿瘤相关基因的突变,有望在早期发现肿瘤高危个体或临床前期病人。目前单基因突变测定阳性率偏低,甚至低于30%[2],限制了这类方法的实际应用。国外于1992年提出多基因突变联合测定的策略,以提高阳性检出率,但多个基因突变测定,过程繁琐,费用昂贵。MSCCp方法能有效地解决这类问题。真实性分析表明MSSCp方法在一次性快速测定基础上,灵敏度和特异度基本一致于单基因测定后的并联结果。对临床标本进行MSSCp测定,突变检出率达61.8%,而单基因测定,检出率在38.2%~47.1%,表明MSSCp能一次性快速而有效地提高基因突变的检出率。本研究方法仍有待于在更大样本或前瞻性观察研究中作进一步评价。

参考文献

1曾光,主编.现代流行病学方法与应用.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1993.61-74.

2黄健,郑树,金胜航,等.散发性大肠癌ApC基因突变研究.中华肿瘤杂志,1996,8:41-43.

3MichaeljB.Translationalresearchandepithelialcarcinogenesis:moleculardiagnosticassaysnow-molecularscreeningassayssoon?JNatlCancerInst,1995,87:1041-1043.

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